背景簡(jiǎn)介
擴(kuò)增子測(cè)序是對(duì)特定長(zhǎng)度的PCR產(chǎn)物或捕獲的片段進(jìn)行測(cè)序，分析序列中的變異。16S/ITS等擴(kuò)增子測(cè)序即通過提取環(huán)境樣品的DNA，選擇合適的通用引物擴(kuò) 16S/ITS的目標(biāo)區(qū)域，通過檢測(cè)目標(biāo)區(qū)域的序列變異和豐度，以研究環(huán)境微生物多樣性及群落組成差異。16S rDNA為編碼原/真核生物核糖體小亞基rRNA的DNA序列。ITS分為兩個(gè)區(qū)域：ITS1位于真核生物rDNA序列18S和5.8S之間，ITS2位于5.8S和28S之間。
技術(shù)優(yōu)勢(shì)
鑒定到“種”：菌群多樣性鑒定率先精細(xì)到“種”，分類更明確。
數(shù)據(jù)庫豐富：基于最新版Greengene和自建數(shù)據(jù)庫，和自主開發(fā)的分析注釋工具，最多可鑒定4414個(gè)種，
覆蓋2106個(gè)屬，可鑒定菌種持續(xù)更新中。
低成本：相比于傳統(tǒng)菌落鑒定，分析通量更高，檢測(cè)成本更低。
技術(shù)路線
分析內(nèi)容
樣本類型
菌體，DNA等
建議總DNA起始量：>20ng(較純DNA，無宿主及其他雜質(zhì)污染)
近期用戶文章
1. Gao, S., et al.（2015）Tolerance response to in situ ammonia stress in a pilot-scale anaerobic digestion reactor for alleviating ammonia inhibition. Bioresource Technology 198:372.
2. Gou, H., et al. (2016) Assessment of microbial communities in PM1 and PM10 of Urumqi during winter." Environmental Pollution 214: 202-210.
3. Huang, Y., B. Yang, and W. Li. (2016) Defining the normal core microbiome of conjunctival microbial communities. Clinical Microbiology & Infection 22.7: 643.e7-643.e12.
4. Lv, Long‐Xian, et al. (2016) Alterations and correlations of the gut microbiome, metabolism and immunity in patients with primary biliary cirrhosis. Environmental Microbiology 18.7:2272.
5. Hu, Jinxiang, et al. (2016) Pepino (Solanum muricatum) planting increased diversity and abundance of bacterial communities in karst area. Scientific Reports 6:21938.
Q1：什么是嵌合體？
A：嵌合體的形成：在PCR時(shí)，當(dāng)不完全的DNA鏈與不同的模板退火時(shí)，嵌合擴(kuò)增子形成，并引發(fā)衍生自兩種不同生物學(xué)序列的新模板的合成。嵌合體在正常生物體中是不存在的。參考文獻(xiàn)：Robert C. Edgar, UCHIME2: improved chimera prediction for amplicon sequencing，2016.
Q2：PCoA分析有多種不同計(jì)算方法及結(jié)果，甚至還有其他不同的分析方法來計(jì)算樣本間距離，我要選哪一種為最終的展示結(jié)果呢？
A：PCoA分析和其他不同的分析方法都是用來展示組間差異和組內(nèi)相似性的結(jié)果，不同的計(jì)算方法相當(dāng)于是不同的角度來看這個(gè)結(jié)果，老師只要選擇與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)最合適的結(jié)果進(jìn)行展示說明即可。
Q3：α多樣性指數(shù)之間有什么區(qū)別嗎？
A：observed_species、chao1指數(shù)用來描述物種的數(shù)目；而shannon、simpson指數(shù)則是用來描述物種多樣性的，這兩個(gè)指數(shù)不僅考慮了物種的數(shù)目，還考慮了物種的豐度，也就是所有物種的均勻度。如果每一個(gè)體都屬于不同的種，多樣性指數(shù)就最大；如果每一個(gè)體都屬于同一種，則其多樣性指數(shù)就最小。如果一個(gè)樣品物種數(shù)目很多，但均勻度很差，即某個(gè)物種豐度很高，但另一物種豐度很低，就會(huì)造成observed_species、chao1指數(shù)高而shannon、simpson指數(shù)不高的現(xiàn)象。簡(jiǎn)單說： observed_species、chao1指數(shù)高，說明樣品物種數(shù)目多；shannon、simpson指數(shù)高，說明物種豐度以及均勻度都很高。
Q4：微生物群落研究方法的區(qū)別？
A：16S rDNA測(cè)序：由于研究對(duì)象只為細(xì)菌的16S rDNA，因此16S測(cè)序技術(shù)更多只用于研究群落物種信息，也就是利用OTU物種分類、α和β多樣性分析等手段解答群落有什么物種，物種關(guān)系是什么等問題。因此，這種技術(shù)更多地只能了解到環(huán)境對(duì)微生物的組成有何影響，更偏向于單向關(guān)系研究。
宏基因組測(cè)序：宏基因組的研究對(duì)象為群落所有DNA，因此研究范圍更廣。理論上不單只可以了解群落的組成和多樣性等物種信息，同時(shí)，利用基因的注釋信息，還可以挖掘群落的核心功能和通路信息，在基因組層面了解這個(gè)群落到底有什么物種，這些物種能夠發(fā)揮什么功能。只有了解群落功能，才能知道它們對(duì)環(huán)境有什么影響，這有利于進(jìn)行微生物與環(huán)境的雙向研究。
宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序：宏轉(zhuǎn)錄組以mRNA為研究對(duì)象，同樣的通過數(shù)據(jù)組裝和比對(duì)，能同時(shí)挖掘物種信息，基因功能信息，發(fā)現(xiàn)新基因，這與宏基因組的作用沒太大差別。它的特點(diǎn)在于，因?yàn)槭寝D(zhuǎn)錄組信息，因此在進(jìn)行基因研究的時(shí)候，可以關(guān)注到基因表達(dá)情況，從而更深入地了解基因如何被調(diào)控，基因表達(dá)如何應(yīng)答環(huán)境變化等細(xì)節(jié)問題，在功能研究上更為細(xì)致。
定義正常人類眼結(jié)膜微生物群落的 "core microbiome"
研究背景
眼部細(xì)菌感染是很常見的，但運(yùn)用傳統(tǒng)培養(yǎng)與分子生物學(xué)方法鑒定結(jié)膜微生物群具有明顯的局限性。而宏基因組研究可以彌補(bǔ)這些方法的缺陷。
研究結(jié)果
黃鈺森組運(yùn)用Illumina高通量測(cè)序技術(shù)（MiSeq 測(cè)序平臺(tái)）對(duì)結(jié)膜擦拭樣本中所有細(xì)菌的16S rDNA V3-V4高變區(qū)進(jìn)行測(cè)序。從測(cè)序數(shù)據(jù)中獲得操作分類單元（OTUs）。接著，進(jìn)行微生物分類、豐度、 α多樣性等生物信息學(xué)分析。從31個(gè)結(jié)膜樣本中得到840373個(gè)高質(zhì)量測(cè)序reads。不同種類的OTU數(shù)量從159到2042，顯示出很高的微生物多樣性。這些細(xì)菌菌落可分為25個(gè)門和526個(gè)不同的屬。在屬的水平，棒狀桿菌屬（28.22%）、假單胞菌屬（26.75%）、葡萄球菌屬（5.28%）、不動(dòng)桿菌屬（4.74%）、鏈球菌屬（2.85%）、 Millisia（2.16%）、厭氧球菌屬（1.86%）、大芬戈?duì)柕戮鷮伲?.68%）、西蒙斯氏菌屬（1.48%）、韋榮氏球菌屬（1.00%）占整個(gè)微生物群落的76%以上，可能代表了正常結(jié)膜微生物群的“core genera” 。
圖 眼結(jié)膜微生物群落分類
參考文獻(xiàn)
Huang YS, et al. (2016) Defining the normal "core microbiome" of conjunctival microbial communities. Clinical Microbiology and Infection. doi:10.1016/j.cmi.2016.04.008.
樣品豐度柱狀圖根據(jù)物種豐度表和物種注釋表，默認(rèn)選取豐度最高的20個(gè)物種分類，進(jìn)行相對(duì)豐度計(jì)算，獲得相對(duì)豐度文件，繪制樣品豐度比較的柱狀圖，該柱狀圖以堆疊柱狀圖 (stacked bar chart)形式展現(xiàn)，便于更直觀地進(jìn)行樣品豐度的比較。在各個(gè)層級(jí)中， 可以直觀的看到優(yōu)勢(shì)菌種的表達(dá)情況及在各個(gè)不同處理中的變化趨勢(shì)。當(dāng)然， 若是有關(guān)注稀有菌群的表達(dá)情況時(shí)，也可以展現(xiàn)所有物種分類。
物種分類熱圖（taxa heatmap）根據(jù)樣品相對(duì)豐度表，將各分類水平相對(duì)豐度最高20個(gè)的群落組成數(shù)據(jù)根據(jù)分類 單元的豐度分布或樣本間的相似程度加以聚類，根據(jù)聚類結(jié)果對(duì)分類單元和樣本 分別排序，并通過熱圖加以呈現(xiàn)。通過聚類，可以將高豐度和低豐度的分類單元 加以區(qū)分，并以顏色梯度及相似程度來反映多個(gè)樣品在各分類水平上組成的相似 性和差異性。
物種注釋結(jié)果KRONA展示使用Krona軟件動(dòng)態(tài)可視化展示單樣品在不同分類水平注釋結(jié)果，通過調(diào)節(jié)不同的參數(shù)來調(diào)整展示的圖片。如果項(xiàng)目比較關(guān)注某一個(gè)物種，可通過在Search欄中輸入關(guān)注物種的名稱，可快速定位到關(guān)注物種在樣品中的表達(dá)情況。通過點(diǎn)擊左側(cè)欄中的樣品名，來展示該樣品的物種注釋表達(dá)情況。
RDA分析RDA分析實(shí)際上是約束化的主成分分析（PCA），它的優(yōu)點(diǎn)是考慮了環(huán)境因子（如土壤研究中的PH值，酸堿度，疾病研究中臨床理化因子等）對(duì)樣本的影響， 可同時(shí)反映樣本，環(huán)境因子和物種三者或兩兩之間的關(guān)系。
LEfSe分析LEfSe分析主要目的是進(jìn)行兩組或多組之間的比較，找到不同組間在豐度上有顯著性差異的物種（biomarker）。
Spearman關(guān)聯(lián)分析主要目的是觀察微生物間（或OTU）的相互作用，通過斯皮爾曼（Spearman）關(guān)聯(lián)系數(shù)計(jì)算等方法，找尋微生物在不同環(huán)境下的可能的相互“協(xié)作”或“競(jìng)爭(zhēng)” 的關(guān)系。
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