以高通量測序為代表的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的突飛猛進，正在對傳統(tǒng)的醫(yī)學(xué)檢驗產(chǎn)生影響，目前已在無創(chuàng)產(chǎn)前篩查、染色體拷貝數(shù)變異篩查、遺傳病致病位點篩查、胚胎植入前診斷等臨床檢驗中心應(yīng)用。隨著國家食品藥品監(jiān)督管理局接連批準(zhǔn)基于高通量測序技術(shù)（NGS），以及伴隨診斷標(biāo)準(zhǔn)審批的多基因腫瘤突變聯(lián)合檢測試劑盒，illumina的儀器也在前幾天獲批，NGS已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域不可忽視的重要技術(shù)。
不同于往常的檢測手段，從樣本處理到檢測結(jié)果，NGS存在諸多繁雜的步驟。只有保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，臨床應(yīng)用才能落到實處。在NGS實驗室的管理體系上不斷優(yōu)化，力求打造管理科學(xué)化，操作規(guī)范化，方法標(biāo)準(zhǔn)化及體系國際化的實驗室，是該行業(yè)大家最關(guān)心的話題。今天我就結(jié)合在工作中踐行的實際情況，淺談“5M1E”分析法在NGS實驗室管理中的應(yīng)用。
“5M1E”其實就是對全面質(zhì)量管理理論中六個影響產(chǎn)品質(zhì)量的主要因素的簡稱，是指6種分析維度與方法，其中五項的英文是以M開頭，一項是以E開頭，分別為：“5M”：Man（人），Machine（機），Material（料），Method（法），Measurement（測）；“1E”：Environment（環(huán)）。
一、 人
人員是NGS實驗室管理中最活躍的因素，對實驗室的全部活動起著主導(dǎo)和支配作用，是決定實驗室檢測質(zhì)量的根本因素。
1、 專業(yè)與能力：因二代測序?qū)嶒灢僮鞯膹?fù)雜性，對NGS檢驗人員的要求不能僅僅停留在簡單進行儀器操作這個層面上。為保證檢驗結(jié)果的快速、準(zhǔn)確，檢驗人員不但要熟練掌握各種儀器的操作，更要了解可能影響檢驗結(jié)果的全方位因素，檢驗人員在技能方面必須有分子生物學(xué)的專業(yè)知識和技術(shù)能力。
2、 教育與培訓(xùn)：人員的培訓(xùn)在保證檢驗質(zhì)量中尤為重要，從事二代測序的檢驗人員在上崗前必須先取得臨檢中心《臨床基因擴增實驗室技術(shù)人員培訓(xùn)合格證》和NGS技術(shù)的理論與技能培訓(xùn)。分析人員需要經(jīng)過生物信息學(xué)的培訓(xùn)。
3、 專才到全才：為了讓檢驗人員可以在保證質(zhì)量的前提下快速上崗，可以將NGS實驗室崗位進行細(xì)分，如收樣、提取、建庫、質(zhì)檢純化、上機測序等，先按單崗進行培訓(xùn)考核上崗，定崗定區(qū)域，等熟練后再進行全方位培訓(xùn)，這樣有助于實驗室人員的安排，也有助于檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。
二、 機
這里是指直接或間接用于檢測分析的，對檢測結(jié)果有影響的儀器設(shè)備及有關(guān)輔助性儀器設(shè)備等，這里包含了測序后數(shù)據(jù)分析軟件。
1、 儀器設(shè)備的校準(zhǔn)與確認(rèn)：對于檢測設(shè)備，經(jīng)過采購、到貨驗收、安裝調(diào)試等過程后，首先在設(shè)備投入使用前進行校準(zhǔn)或驗證確認(rèn)，確保用于檢測的設(shè)備及其軟件達(dá)到檢測的準(zhǔn)確度和規(guī)范性。當(dāng)校準(zhǔn)報告給出一組修正因子時，需要將其校準(zhǔn)因子在實際中正確運用，否則會有儀器偏差引入。
2、 數(shù)據(jù)分析軟件：這是NGS實驗室特有的環(huán)節(jié)，實驗室需要用商品試劑配套的軟件進行數(shù)據(jù)分析，并確認(rèn)使用軟件的版本和數(shù)據(jù)庫的現(xiàn)行有效版本；數(shù)據(jù)需要專業(yè)的生信人員進行分析，需要在數(shù)據(jù)預(yù)處理、數(shù)據(jù)比對、數(shù)據(jù)質(zhì)控、分析判斷等每個流程進行質(zhì)控，確保數(shù)據(jù)分析的準(zhǔn)確性。
3、 儀器的配套使用：需要使用商品試劑申報時的配套儀器型號，如燃石人EGFR/ALK/BRAF/KRAS 基因突變聯(lián)合檢測試劑盒（可逆末端終止測序法）受理號為CSZ1700157，配套儀器為Illumina 公司生產(chǎn)的MiSeqDx，雖然Illumina公司有MiSeq、MiniSeq、NextSeq500等不同型號的測序儀，但在檢測過程中必須選用MiSeqDx型號的儀器，否則儀器之間的差異會影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。
4、 設(shè)備的標(biāo)識：設(shè)備標(biāo)識是設(shè)備管理過程中非常重要的一個環(huán)節(jié)，設(shè)備要有一個唯一性編號的標(biāo)識，這個編號是唯一性的，即使是同樣型號的儀器也不允許重復(fù)，只有這樣才能做到檢測數(shù)據(jù)的溯源性要求。還有設(shè)備的運行、維修、暫停等狀態(tài)也需要做好標(biāo)識，防止設(shè)備的非預(yù)期使用影響到檢測結(jié)果。
5、 設(shè)備的維護和保養(yǎng)：設(shè)備要定期做好維護和保養(yǎng)，一般校準(zhǔn)和驗證的周期為1年，中間可以采用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或同型號設(shè)備進行比對，確保設(shè)備的性能，保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。如設(shè)備有大的關(guān)鍵零件的維修更換、精密儀器的位置搬動等，需要對設(shè)備的性能重新進行驗證確認(rèn)。如測序儀等設(shè)備對外界環(huán)境有溫濕度要求的，要確保環(huán)境符合要求，并做好監(jiān)控和記錄，否則外界環(huán)境對檢測結(jié)果也會存在影響。
三、 料
這里是指不局限于實驗室的試劑和耗材，還包含檢測的樣本，檢測記錄和報告。
1、 樣本：要確保NGS檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，樣本的質(zhì)量起著關(guān)鍵性的決定作用，實驗室應(yīng)制定正確采集處理原始樣品、標(biāo)識及樣品質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)的文件化程序。
1.1 采集活動前的指導(dǎo)：如采集的方法、影響采集方法的因素，樣本采集的類型和量、樣本存儲的容器和必需添加物。
1.2 采集活動的指導(dǎo)：采集患者身份的確認(rèn)，采集樣本的原始標(biāo)識，采集時間等。
1.3 樣品的存儲和標(biāo)識：從樣品接收開始直到報告出具，樣品存儲溫度的要求、使用的保存液等，在整個實驗室流轉(zhuǎn)過程中都具有唯一性標(biāo)識，防止混淆。除了樣本本身的區(qū)別標(biāo)識，還應(yīng)該有樣品的狀態(tài)標(biāo)識，如待檢、檢測中、已檢三種狀態(tài)，分別存放在不同的區(qū)域中。
1.4 制定樣本的質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)：如石蠟包埋(FFPE)的非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)組織樣本，腫瘤細(xì)胞含量應(yīng)達(dá)20%以上，提取的DNA量應(yīng)大于50ng才能開始NGS的下一步檢測。如樣本質(zhì)檢不合格需要重新進行采樣，如不進行樣本的質(zhì)檢直接進入下一道工序，到最后發(fā)現(xiàn)檢測結(jié)果不符合要求，耗時又耗錢，耽誤患者用藥時間。
2、 試劑
實驗室應(yīng)制定用于試劑的接收、驗收、使用、存儲的文件，試劑到貨時進行外觀及性能的進貨驗收，按照存儲溫度及批號規(guī)則進行試劑的存放，按照批號、效期的原則錄入到系統(tǒng)并做好庫存卡，試劑領(lǐng)用做到先進先出。商品化試劑在用于臨床樣本檢測應(yīng)進行有效的性能驗證（如準(zhǔn)確性、靈敏度、特異性）。
NGS的商品試劑因都是低溫保存，一般都會有開瓶有限期和反復(fù)凍融次數(shù)要求，實驗室在使用過程中需要及時記錄開瓶日期和凍融次數(shù)，使用時可根據(jù)需要進行分裝，避免反復(fù)凍融。若分裝后的物料需要繼續(xù)保存，則應(yīng)注明物料名稱、原瓶開瓶日期、分裝日期等信息，確保試劑的可靠性。
3、 耗材
NGS實驗室都會用到各種規(guī)格的移液器槍頭、PCR管、離心管等一次性耗材，市場上有眾多的廠家及規(guī)格型號，在NGS實驗過程中請確保使用無菌、濾芯、低吸附的規(guī)格型號；同時確保無脫氧核糖核酸酶（DNase）和核糖核酸酶（RNase）污染。
4、 記錄和報告
記錄和報告也是一種特殊的物料，記錄設(shè)計要有檢測樣本、使用的設(shè)備編號、使用的試劑批號、檢測日期、檢測人、復(fù)核人、檢測結(jié)果的原始數(shù)據(jù)等信息，方便追溯。每個實驗環(huán)節(jié)需要及時、準(zhǔn)確、真實填寫各種記錄，定期整理歸檔管理。檢測報告內(nèi)容應(yīng)包含但不局限于患者人員信息、病歷信息、樣本信息、所用試劑和分析軟件信息、檢測結(jié)果及解釋，報告人及有簽發(fā)報告資質(zhì)人員的簽名。報告應(yīng)簡潔扼要、通俗易懂。
四、 法
為了使NGS實驗規(guī)范管理，操作標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一，保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，需要制定各種程序性文件、作業(yè)指導(dǎo)書、記錄表單，文件保持現(xiàn)行有效版本，方便員工隨時取閱，做到“有法可依、有法必依、執(zhí)法必嚴(yán)、違法必究”。
1、 程序性文件：可以參照CNAS-CL02:2012《醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則》的要素建立實驗室管理的質(zhì)量手冊和程序性文件。
2、 操作性規(guī)程：可以采用圖文并茂的方式建立實驗操作細(xì)節(jié)、設(shè)備操作規(guī)程、質(zhì)控方法及質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)等。
3、 記錄表單：可以根據(jù)NGS的工序如收樣、提取、建庫、純化、上機測序各工序形成全套的實驗操作記錄；另外如設(shè)備使用、維護、保養(yǎng)記錄、溫濕度監(jiān)控記錄、試劑的配置記錄等配套的各類表單，均由質(zhì)量部受控發(fā)放使用。
五、 測
為了提高檢測結(jié)果準(zhǔn)確性和可靠性所采取的有關(guān)措施和活動。
1、 實驗室間質(zhì)評（EQA）：也叫室間質(zhì)量評價，是國家衛(wèi)健委利用各實驗室間的比對來確定實驗室能力的活動，實際上它是指為確保實驗室維持較高的檢測水平而對其能力進行考核、監(jiān)督和確認(rèn)的一種驗證活動。這是NGS實驗室證明自己能力的一種很好的方式，也是自己實驗室技術(shù)能力在行業(yè)中展示的一個窗口，應(yīng)該積極報名參加。
2、 實驗室間比對：實驗室間比對是按照預(yù)先規(guī)定的條件，由兩個或多個實驗室對相同或類似的測試樣品進行檢測的組織、實施和評價，從而確定實驗室能力、識別實驗室存在的問題與實驗室間的差異，是判斷和監(jiān)控實驗室能力的有效手段之一。
3、 人員比對：為了提高自己實驗室人員的技能，建議定期開展人員比對活動，這是維持和提高檢驗人員能力水平的一種很好的手段。倡導(dǎo)實驗室形成你追我趕的氛圍，不斷提升實驗人員的技能。
4、 盲樣測試：能直接反映實驗室的儀器設(shè)備和技術(shù)水平，可以作為實驗室技術(shù)人員轉(zhuǎn)正考核的一種手段。
5、 陽性對照和陰性對照：每次檢測都必須放置陽性對照和陰性對照，作為最終判斷結(jié)果的參考依據(jù)。陰性質(zhì)控品(NC)的檢測結(jié)果應(yīng)為陰性，若其中有突變檢出，說明環(huán)境中可能存在DNA污染源。陽性質(zhì)控品(PC)的檢測結(jié)果應(yīng)為某個基因突變對應(yīng)陽性，如果突變未檢出，說明試劑盒性能不理想或操作過程有誤，此次檢測結(jié)果無效。
六、 環(huán)
這里是指檢測過程中的實驗室硬件環(huán)境。
1、 實驗室設(shè)計布局：NGS實驗室設(shè)置應(yīng)該嚴(yán)格按照國家衛(wèi)健委高通量測序?qū)嶒炇业囊筮M行，申請臨床基因擴增檢驗實驗室驗收，標(biāo)準(zhǔn)化分區(qū)及空氣流向，確保工作有序，互不干擾，防止污染。
一般腫瘤領(lǐng)域二代測序分為試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本與文庫制備區(qū)、DNA打斷區(qū)、雜交捕獲區(qū)（擴增一區(qū)）、文庫擴增區(qū)（擴增二區(qū)）、文庫檢測區(qū)、測序區(qū)、電泳區(qū)共八個區(qū)，每個房間壓差依次梯度≥5Pa，設(shè)置PCR專用走廊和緩沖間，在緩沖間內(nèi)，可設(shè)置正壓，使室內(nèi)空氣不流向室外，室外空氣不流向室內(nèi)。嚴(yán)格人流物流分開，嚴(yán)格遵守從一區(qū)到八區(qū)的單一方向制度，不得反向進入前一個區(qū)，盡量減少在實驗區(qū)內(nèi)不必要的走動，以減少交叉污染。
2、 區(qū)域管理：在各個實驗區(qū)使用帶有明顯區(qū)別標(biāo)志的工作服和物品（如不同顏色），每個工作區(qū)域均有專用的儀器設(shè)備，各區(qū)域儀器設(shè)備須有明確的標(biāo)記，避免設(shè)備物品如加樣器等從其各自的區(qū)域內(nèi)移出。當(dāng)工作人員離開時，不得將本區(qū)的工作服、手套、口罩和物品帶到其他區(qū)域，從而造成不同的工作區(qū)域間設(shè)備物品發(fā)生混淆污染。
3、 環(huán)境衛(wèi)生：每個區(qū)域都應(yīng)該有獨立的清潔工具，每個區(qū)域的清潔工具不得混用，清潔時按照從一區(qū)到八區(qū)的單一方向制度。工作結(jié)束后用75%的乙醇擦拭工作臺面，用紫外線燈（建議安裝無臭紫外燈）進行照射，同時注意實驗室的通風(fēng)換氣。
國家原衛(wèi)計委李大川處長在近期會議上肯定了近年來分子檢測在臨床中的突出貢獻，隨著精準(zhǔn)醫(yī)療的發(fā)展，分子檢測不僅有助于疾病的診斷分類，而且加深了人們對疾病的認(rèn)識，指導(dǎo)疾病的靶向治療。但是NGS檢測的質(zhì)量控制仍然存在問題：實驗室設(shè)計、實驗室人員水平、質(zhì)量保證手段等。我們只有有效運用“5M1E”分析法，規(guī)范NGS實驗室管理，保證質(zhì)量，向臨床提供真實、客觀、準(zhǔn)確的檢測結(jié)果，才能更好地為大眾健康服務(wù)。
